ISSN: 2344-8636
2015; 3 (1): 33-44
Enero Junio
DOI: 10.17081/innosa.3.1.234
33
Efectos de un preparado probiótico en un modelo de colitis
experimental crónica en ratones, inducida por la ingesta de
dextrano sulfato sódico (DSS)
Effects of a probiotic preparation in an experimental model of
chronic colitis in mice, induced by the intake of dextranesulphate
sodium (DSS)
Bolívar-González S¹, Talero Barrientos E², Motilva Sánchez V²
¹ Prog. Farmacia, Fac. Farmacia Universidad del Atlántico (Baq, Col), ² Dep. de Farmacología, Fac. de Farmacia, Universidad de Sevilla (Sev, Esp)
Resumen – La Colitis Ulcerosa es considerada una enfermedad
inflamatoria intestinal de etiología desconocida. La ingesta de
probióticos, representa una opción terapéutica novedosa para alterar la
flora intestinal mediante el aumento de la concentración de bacterias
beneficiosas y la reducción en los niveles de microorganismos
patógenos.
Objetivo: Determinarlos efectos profilácticos o curativos de un
preparado probiótico en un modelo de colitis experimental en ratones,
inducida por el dextrano sulfato de sodio.
Materiales y Métodos: Los ratones son expuestos a 5 ciclos de
tratamiento, cada ciclo consiste en la administración de dextrano
sulfato de sodio durante una semana en el agua de bebida, al 0,7%,
seguida de agua potable durante 10 días. El preparado probiótico fue
administrado antes de la inducción de la colitis o de forma conjunta con
su inducción. Después de cada período, los animales son sacrificados y
se realizan estudios macroscópicos e histológicos, se calcula el índice de
actividad de la enfermedad, así como la caracterización de
biomarcadores inflamatorios.
Resultados: La administración del preparado probiótico atenuó el índice
de actividad de la enfermedad y la inflamación del colon después de los
5 ciclos del dextrano sulfato de sodio, así mismo redujo las alteraciones
histológicas. Además, disminuyó la expresión proteica y génica de
marcadores inflamatorios en el tejido del colon durante el periodo
evaluado.
Conclusión: La administración del preparado probiótico, previene o
retrasa los signos externos de la colitis, así como los niveles proteicos y
génicos de marcadores inflamatorios asociados a ella.
Palabras Claves: Probióticos, colitis, enfermedad inflamatoria intestinal,
citoquinas (Fuente: DeCS).
Correspondencia: Samir Bolívar González, Facultad de Química y Farmacia,
Universidad del Atlántico, Km 7 Vía Puerto Colombia, Teléfono 3197227, Barranquilla-
Colombia. samirbolivargonzalez@hotmail.com.
Citar: Bolívar-González S, Talero Barrientos E, Motilva Sánchez V. Efectos de un
preparado probiótico en un modelo de colitis experimental crónica en ratones, inducida por
la ingesta de dextrano sulfato sódico (DSS). Cienc e Innovación en Salud [Internet]. 2015
Jan 1;3(1):1–1. Available from:
http://publicaciones.unisimonbolivar.edu.co:82/rdigital/ojs/index.php/innovacionsalud/article
/view/239/234.
Parte de este trabajo se encuentran soportado en la investigación titulada «Efectos de
un preparado probiótico en un modelo de colitis experimental crónica en ratones, inducida
por la ingesta de dextrano sulfato sódico (DSS)» tesis para obtener el título de Máster en
Atención Hospitalaria de la Universidad de Sevilla (España).
Recibido: Oct. 12 de 2014 / Modificado: Nov. 11 de 2014 / Aceptado: Nov. 21 de 2014.
Abstract – The ulcerous colitis is considered an inflammatory
intestinal disease of unknown etiology. The intake of probiotic
represents a new therapeutic option to alter the gut flora through the
increase of concentrations of beneficial bacteria and the decrease of
the levels of pathogenic microorganisms.
Objective: Determine prophylactic or curative effects of a probiotic
preparation on a model of experimental colitis in mice induced by
dextran sodium sulfate.
Materials and Methods: The mice were exposed to 5 treatment cycles,
each consisting in administering dextranesulphate sodium in soda water
0.7% for one week, and then potable water for 10 days. The probiotic
preparation was administered before inducing colitis or jointly with
induction. After each period, the animals were sacrificed and
macroscopic and histological studies, and the index of disease activity
was calculated, as well as the characterization of inflammatory
biomarkers.
Results: The administration of the probiotic preparation alleviated the
index of disease activity and the colon inflammation after the 5 cycles
of dextranesulphate sodium, reducing as well the histological
alterations. Also, the protein and gene expression of the inflammatory
markers in the colon tissue decreased during the evaluated period.
Conclusion: The administration of the probiotic preparation prevents or
retards the external signs of colitis, and protein and gene levels of
inflammatory markers associated with it.
Keywords: Probiotics, colitis, intestinal inflammatory disease, cytokines
(Source: MeSH, NLM).
INTRODUCCIÓN
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un
grupo de enfermedades caracterizadas por la
inflamación del intestino delgado y grueso e incluye
principalmente Colitis Ulcerativa (CU) y la Enfermedad
de Crohn (EC). Aunque la etiología de la EII no se
entiende completamente, se cree que es el resultado de
la interacción de factores genéticos, inmunológicos, y los
factores ambientales, incluyendo la microbiota intestinal
(1).Ambas formas de EII, se caracterizan por ser
crónicas, deterioran significativamente la calidad de
vida, requieren prolongadas intervenciones médicas y
34 Bolívar-González S, Talero Barrientos E, Motilva Sánchez V.
Cienc. innov. salud. Enero - Junio 2015; 3 (1): 33-44. Universidad Simón Bolívar (Col).ISSN: 2344-8636
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quirúrgicas, y representan una carga importante para la
sociedad en general. Lo que hace particularmente difícil
el tratamiento de esta enfermedad son sus causas, aún
desconocidas. En la actualidad se viene estructurando la
idea de que no se está ante una enfermedad en singular
(EII), ni tampoco ante la simple dicotomía de una pareja
ante un amplio espectro de procesos patológicos que
surgen desde factores etiológicos y caminos patogénicos
diferentes, para terminar en un hecho biológico con un
común denominador, que es la inflamación crónica y
recurrente de la pared intestinal (2). Durante años
muchas teorías se han propuesto para explicar su
patogénesis, incluyendo causas que van desde
infecciosas a psicosomáticas, sociales, metabólicas,
vasculares, genéticas, alérgicas, autoinmunes e
inmunitarias (3, 4). En este sentido, se considera que
estas enfermedades son la consecuencia de una
respuesta inmune inadecuada que provocaría una
inflamación mantenida en la mucosa intestinal y que
ocurre en individuos susceptibles genéticamente como
consecuencia de una compleja interacción entre factores
medio-ambientales, microbiológicos e inmunes (5).
En el intestino normal, los macrófagos están
condicionados por el microambiente de la mucosa para
expresar un fenotipo no inflamatorio, traducido por una
expresión disminuida de los receptores de la inmunidad
innata y la limitada producción de citocinas pro-
inflamatorias (6). La creciente evidencia apoya el papel
de diversas citocinas liberadas por las células epiteliales
e inmunes, en la patogénesis de la CU asociada a
neoplasia. Se ha sugerido que existen dos mediadores
claves en el proceso inflamatorio, la ciclooxigenasa-2
(COX--
transcriptores, los cuales serían los vínculos más
destacados entre la inflamación y el cáncer.
Recientemente, se ha demostrado que otros factores
tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-
señalización de interleucina 6 (IL-6) promueven el
crecimiento tumoral en modelos experimentales de
cáncer asociado a colitis (CAC) (7).Además, se ha
informado de que el aumento de la proliferación celular
epitelial asociada con ciclos repetitivos de inflamación,
daño, y la regeneración en caso de UC podría conducir a
la carcinogénesis en el largo plazo. En este contexto, la
CU puede ser modelada en ratones mediante la
exposición repetida al sodio sulfato de dextrano (DSS),
un agente con efectos tóxicos directos sobre el epitelio
del colon. Este modelo ha demostrado las características
clínicas e histopatológicas similares a los observados en
UC humana (8).En diversos modelos animales han
descubierto un papel central de la flora intestinal en el
desarrollo de la colitis, principalmente por la inducción
de las células Th17 o células T reguladoras (9). La
convergencia de los resultados demuestra que la flora
intestinal desempeña un papel central en la patogénesis
de esta enfermedad, es así, como los investigadores
vienen realizando estudios clínicos que pretenden
encontrar beneficios terapéuticos luego de la
manipulación en la flora intestinal. Por lo anterior, cada
día se reconoce un creciente interés en la comunidad
científica sobre el papel protector de los probióticos en
las enfermedades intestinales, especialmente en la EII
(10, 11).
Los probióticos son microorganismos vivos, que
cuando llegan en cantidades suficientes al intestino en
un estado activo, ejercen efectos positivos para la salud
(12). En su mayoría incluyen bacterias y levaduras
productoras de ácido láctico que alcanzan el intestino
sin alteraciones, y además sin proporcionar daño al
huésped (13, 14).En este sentido, por sus acciones
inmunomoduladoras y antiinflamatorias, se conocen
diferentes aplicaciones de los probióticos en la
prevención de infecciones intestinales, cáncer y
enfermedades cardiovasculares (15, 16).En el intestino,
los probióticos son capaces de ocupar nichos de la
mucosa, impidiendo a los patógenos invadir esas zonas.
Además, ejercen una acción local semejante a los
antibióticos contra microorganismos patógenos y
disminuyen la producción de citocinas pro-inflamatorias,
tales como interferón-gama (IFN--
2 (IL-2). También presentan la capacidad de modular las
vías dependientes del NF-
relacionado con el establecimiento de la tolerancia
inmunológica (17). Sin embargo, pocas investigaciones
han abordado el efecto de los probióticos en modelos
experimentales de colitis, y los resultados que existen
son contradictorios. En esta línea, se ha demostrado que
la administración profiláctica del preparado probiótico
redujo la inflamación intestinal y carcinogénesis (18);
por el contrario, la administración de probióticos no
altero el ambiente inflamatorio del colon en un modelo
animal de colitis asociado a cáncer (10).Este estudio tuvo
como objetivo determinar los efectos de un preparado
probiótico, cuando se administra como tratamiento
preventivo o concurrente con la colitis inducida por el
DSS, en ratones. Se ha observado, en la secuencia de la
inflamación crónica intestinal inducida en los ratones,
los efectos del preparado probiótico sobre la expresión
de COX-2, así como los niveles de citoquinas pro-
inflamatorias, tales como TNF-
Efectos de un probiótico en un modelo de colitis experimental crónica en ratones por la ingesta de DSS 35
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demuestran que el preparado probiótico mejora la
colitis crónica en ratones y brinda un potencial uso
terapéutico en pacientes con EII crónica.
MATERIALES Y MÉTODOS
ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Los experimentos siguieron un protocolo estipulado
por el Comité de Ética Animal de la Universidad de
Sevilla, además, todos los experimentos estaban en
conformidad con las recomendaciones de la Unión
Europea en relación con la experimentación animal
(Directiva del Consejo Europeo 2010/63/UE). Los
animales fueron mantenidos en condiciones estándares
de estabulización a 24-25 ºC, doce horas de luz al día y
alimentación controlada. En los estudios experimentales
el número de animales utilizado por cada grupo ha
estado comprendido entre 6-10. Se utilizaron ratones
hembra de la cepa C57BL/6 de 6 semanas de edad, de
peso comprendido entre 20-25g, suministrados por el
Centro de Producción y Experimentación Animal de la
Universidad de Sevilla.
PREPARADO PROBIÓTICO
El preparado probiótico utilizado se obtuvo de Actial
Farmacéutica Lda(Portugal), es una mezcla de 5 cepas
bacterianas productoras de ácido láctico (Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus
plantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium
infantis).La dosificación empleada atendiendo a la
bibliografía consultada, mencionan que por cada 100
gramos de ratón/5 billones de Unidades Formadoras de
Colonias (UFC) de probiótico/día.
Anteriormente, fue necesario llevar a cabo
experimentos in vitro para determinar el número de
bacterias que sobreviven en presencia de DSS, y así
comprobar que la viabilidad del probiótico no se ve
influida por el DSS.
DISEÑO DE LOS GRUPOS EXPERIMENTALES DE ANIMALES
1. Para el presente estudio se establecieron los
siguientes grupos experimentales de
animales:
1. Agua, constituido por 10 ratones que
recibieron agua potable a lo largo de todo el
experimento.
2. Probiótico, constituido por 10 ratones que
recibieron el agua potable complementada
con el preparado probiótico a lo largo de
todo el experimento.
3. DSS, constituido por 15 ratones que
recibieron 5 ciclos de DSS. Cada ciclo
consistió en la administración oral cíclica de
DSS al 0.7% durante 7 días consecutivos,
seguido por un periodo de agua de 10 días.
4. DSS + Pre-
ratones que fueron pre-tratados con el
preparado probiótico durante 14 días previos
a la inducción de la colitis. Tras ese periodo,
recibieron 5 ciclos de DSS al 0.7% y se
continuó con la administración del preparado
probiótico a lo largo de todo el experimento.
5. DSS + Probiótico, constituido por 15 ratones
que recibieron 5 ciclos de DSS al 0.7%, así
como también el preparado probiótico a lo
largo de todo el experimento.
MODELO DE COLITIS ULCEROSA CRÓNICA
El modelo experimental utilizado es un modelo de
inflamación intestinal crónica propuesto por Yeo y cols.,
(2006) (19). La colitis fue inducida por administración
oral cíclica de DSS al 0.7% durante 7 días consecutivos,
seguido por un periodo de agua de 10 días. El DSS
provoca infiltración leucocitaria en la mucosa, lesiones
inflamatorias y diarrea sanguinolenta. Los animales
fueron sacrificados después de 5 ciclos (85 días) de DSS.
EVALUACIÓN DE LA SEVERIDAD DE LA COLITIS Y ANÁLISIS
MACROSCÓPICO DE LAS LESIONES
Durante todo el periodo experimental se valoraron las
manifestaciones clínicas de la colitis para determinar el
índice de actividad de la enfermedad (DAI), el cual
engloba la presencia de diarrea, el sangrado rectal y la
pérdida de peso de los animales. Estos tres parámetros
se evaluaron por separado en una escala de cero (0) a
tres (3) según el método propuesto por Gommeaux y
cols., (2007) (20) (Tabla 1) y el promedio de los tres
valores constituyó el DAI. Al finalizar el periodo
experimental (5 ciclos de DSS), los animales fueron
sacrificados mediante inyección i.p. de hidrato de cloral
al 4% y se extirpó el colon en su totalidad para su análisis
macroscópico, histológico y bioquímico. La relación
peso/longitud del colon fue igualmente evaluada.
Tabla 1 Escala propuesta por Gommeaux y cols., (2007) para la
determinación del índice de la actividad de la enfermedad (DAI).
Escala
Sangrado
Pérdida
de peso
(%)
Consistencia de
heces
0
Ninguno
< 1
Deposiciones
normales
1
Pequeñas manchas de
sangre en heces; región anal
sin sangre.
1-4.99
Heces blandas no
adheridas al ano.
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Escala
Sangrado
Pérdida
de peso
(%)
Consistencia de
heces
2
Grandes manchas de sangre
en heces; sangre en orificio
anal.
5 - 10
Heces muy
blandas
adheridas al ano.
3
Heces totalmente
hemorrágicas; sangre
extendida por todo el ano.
> 10
Diarrea intensa.
ESTUDIO HISTOLÓGICO DE LAS LESIONES DEL COLON
Para llevar a cabo el análisis microscópico del daño
colónico, se seleccionaron al azar 5 animales por grupo.
Se procedieron a extraercon escalpelo secciones de
zonas parcialmente ulceradas del colon de los ratones,
que se sumergieron en formol al 4% durante 24horas. A
continuación, las muestras se sometieron a una
deshidratación mediante alcoholes de concentración
creciente y se incluyeron en parafina. Seccion
de grosor cortadas en un ultramicrotomo Leica Ultracut
se sometieron a un proceso de desparafinación e
hidratación para ser teñidas con hematoxilina/eosina.
Dichas preparaciones fueron examinadas
microscópicamente, utilizándose los objetivos 4x, 10x y
20x. La puntuación para la inflamación es una
adaptación de Okayasu et al. (1990) (21): Grado 0: La
cripta intacta, Grado 1: La infiltración de neutrófilos y la
pérdida de la parte basal de la cripta, Grado 2: La
infiltración de neutrófilos, con la pérdida de toda la
cripta pero epitelio superficial intacto, Grado 3: La
infiltración de neutrófilos con la pérdida tanto de la
cripta como del epitelio superficial. El análisis de las
imágenes fue realizado utilizando una cámara ALTRA 20
(Olympus CX41) acoplada a un sistema de análisis de
imágenes automático (AnalySISgetlT).
DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE CITOCINAS
Los niveles de la citocina pro-inflamatoria TNF-
fueron determinados por una técnica de inmunoanálisis
enzimático cuantitativo tipo sandwich, utilizando el kit
MurineTNF-
de la técnica, las muestras fueron homogeneizadas en
tampón fosfato sódico (PBS) (pH 7.2) conteniendo
albúmina bovina (BSA) 1% y centrifugadas (12,000 rpm,
10 min). Los diferentes patrones y las muestras se
pipetearon en pocillos recubiertos de un anticuerpo
monoclonal específico para la citocina en estudio. Tras el
lavado, se adicionó un anticuerpo policlonal específico
para la citocina unido a una peroxidasa y los substratos,
peró -
tetrametilbencidina). La reacción enzimática produjo un
color azul que cambió a amarillo tras la adición de ácido
sulfúrico 1M. La intensidad de color se midió a 450 nm
en un lector de placa. Los resultados fueron expresados
en picogramos de citocina/mg de tejido.
ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN PROTEICA MEDIANTE WESTERN BLOT
En muestras de mucosa colónica se valoraron los
niveles de expresión de la proteína COX-2 mediante
electroforesis en geles de dodecil sulfato sódico
(SDS)/poliacrilamida y posterior transferencia a
membrana de nitrocelulosa, y análisis inmunológico,
usando anticuerpos monoclonales específicos (Western
Blot). Las muestras fueron procesadas por
homogenización en frío con tampón de lisis compuesto
por Tris HCl 50 mM pH 7.5, MgCl2 8 mM, ácido etilen
glicol- -aminoetiléter) tetraacético (EGTA) 5 mM,
EDTA 0.5 mM, leupeptina 0.01 mg/ml, pepstatina 0.01
mg/ml, aprotinina 0.01 mg/ml, fenilmetilsulfonil fluoruro
(PMSF) 1mM y NaCl 250 mM. A continuación los
homogeneizados fueron centrifugados (12,000 rpm, 15
min, 4ºC) y posteriormente se recogió el sobrenadante,
que se conservó a -80ºC. La concentración de proteínas
del homogeneizado fue determinada aplicando el
método colorimétrico de Bradford (1976) (22).
La separación de las proteínas se llevó a cabo
empleando geles de SDS-poliacril-amida al 10-12%. Se
-mercaptoetanol, desnaturalizadas
previamente a 100ºC. Una vez finalizada la
electroforesis, las proteínas se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa y posteriormente se
bloquearon con leche desnatada en polvo (5% p/v). Las
membranas fueron incubadas con el anticuerpo primario
específico para COX-2 durante toda la noche a 4ºC. Al
día siguiente, tras sucesivos lavados, se procedió a la
incubación con el anticuerpo secundario específico y
finalmente, al revelado de los complejos antígeno-
anticuerpo mediante un kit de quimioluminiscencia
(SuperSignal® West FemptoChemiluminescentSubstrate)
suministrado por Pierce (USA).
RT-PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN
TRANSCRIPCIÓN INVERSA)
En muestras de colon se valoraron los niveles de
expresión del ARNm del gen de TNF-
extraído a partir de muestras de colon utilizando el kit
comercial denominado SV Total RNA IsolationSystem
(Promega, EE.UU.) en un ambiente libre de RNasa. La
transcripción inversa se llevó a cabo utilizando1-2 mg de
-StrandSynthesisSystemfor
RT-PCR (Invitrogen, EE.UU.), oligo (dT) primer 16, dNTP
(0,5 mM) y un inhibidor de RNasa. Después de la
incubación a 65 °C durante 5 minutos y 42 °C durante 50
Efectos de un probiótico en un modelo de colitis experimental crónica en ratones por la ingesta de DSS 37
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min, se detuvo la reacción con un choque térmico a 70
°C durante 15 min. La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) se llevó a cabo con la enzima
Japón) y 0,2 µM de cada conjunto de cebadores para
TNF-
desnaturalización a 95 °C durante 3-5 segundos,
hibridación a 55-60 °C durante 10-20 segundos, y
extensión a 72 °C durante 6-15 segundos. Las secuencias
de los primer utilizados fueron lo
-
y 5'-GTG GGC CGC CCT AGG CAC AG-3 ' (hacia adelante),
5'-AGA GGA GGAGGA TGC GGC AG T-3 '(al revés) para
GADPH como control de la PCR.
TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS
Los resultados han sido expresados como la media
aritmética, error estándar, y la significación de las
diferencias entre los grupos ha sido evaluada utilizando
el análisis de la varianza (test de ANOVA) seguido del
test de Tukey-Kramer para datos paramétricos y la U de
Mann-Whitney para datos no paramétricos. El análisis
estadístico ha sido realizado utilizando el programa
informático GraphPadPrisma ® 5.01.
Las imágenes de histología y western blot son
representativas de al menos tres experimentos
realizados en diferentes días.
RESULTADOS
EFECTOS DEL PREPARADO PROBIÓTICO SOBRE LA ACTIVIDAD CLÍNICA
DE LA ENFERMEDAD Y LOS DAÑOS MACROSCÓPICOS EN EL COLON
La administración oral de 5 ciclos de DSS al 0,7% en el
agua de bebida indujo en los animales un cuadro
importante de colitis inflamatoria crónica, que se
correlacionó positivamente con el número de ciclos de
DSS administrados. En el grupo control DSS, el análisis
del DAI, referido a los signos externos de la colitis
(presencia de diarrea, sangrado rectal y pérdida de peso)
demostró que la enfermedad ya estaba presente a partir
del segundo ciclo y su gravedad se incrementó gradual y
significativamente a medida que los ciclos con DSS
avanzaban. Sin embargo, en los grupos DSS + pre-
probiótico y DSS + probiótico se observó una
disminución significativa en los valores del DAI a lo largo
de todos los ciclos ensayados, con respecto al grupo
control DSS (figura 1).
Figura 1 Índice de actividad de enfermedad (DAI) en el modelo
experimental de colitis ulcerosa inducida por dextrano sulfato sódico
(DSS) en ratones. El DAI se calcula como la media de las puntuaciones
de sangrado, la pérdida de peso y la consistencia de las heces. (***)
p<0.05 vs. Agua, (+++) p<0.05 vs. DSS.
Una vez que los diferentes grupos de animales fueron
sacrificados, medimos la longitud del tejido colónico,
aplicado como un indicador de inflamación. Como era de
esperar, los resultados evidenciaron un marcado
acortamiento del colon en los animales que únicamente
recibieron DSS. Sin embargo, en los grupos DSS + pre-
probiótico y DSS + probiótico se detectó una mayor
longitud del colon, lo cual puede ser indicativo de cierta
mejoría en dichos animales tras la administración del
preparado probiótico (figura 2 y 3).
Figura 2 Proporción de longitud de tejido colónico de los grupos en el
estudio. (***) p<0.001 vs. Agua, (+++) p<0.001 vs. DSS.
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Figura 3 Imágenes representativas del aspecto macroscópico de la
mucosa colónica de animales de los diferentes grupos del estudio:
Agua, DSS, DSS + Pre-Probiótico y Probiótico.
EFECTOS DEL PREPARADO PROBIÓTICO SOBRE LOS DAÑOS
MICROSCÓPICOS EN EL COLON
En los cortes histológicos de tejido colónico de
animales sanos de nuestro estudio (figura 4A) se
observó una estructura normal sin inflamación, displasia
o ulceración. Sin embargo, la administración de 5 ciclos
de DSS al 0,7% en el agua de bebida provocó una
inflamación generalizada, caracterizada por abscesos en
las criptas y alteración de la estructura glandular.
Además, se detectó la presencia de un infiltrado
inflamatorio leucocitario con granulocitos, monocitos y
macrófagos en la mucosa y submucosa. Sin embargo, no
se observó destrucción total del epitelio superficial
(figura 4B). En los cortes histológicos obtenidos en los
gruposDSS + pre-probiótico y DSS + probióticose apreció
una notable disminución del infiltrado inflamatorio y una
mayor conservación de la estructura glandular con
respecto al colon del grupo control DSS (figura 4C-D).
Figura 4 Imágenes microscópicas del colon de los grupos en estudio.
(A) Morfología normal de la mucosa del colon en animales sanos. (B)
Estructura de mucosa afectada en animales del grupo control de
dextrano sulfato de sodio (DSS), en los cuales son evidentes la
inflamación y displasia leve. (C-D) Estructura de la mucosa del colon de
animales de grupos DSS + Pre-Probiótico y DSS + Probiótico,
respectivamente, en los cuales se observa una clara disminución del
infiltrado de células inflamatorias, así como también una mayor
conservación de la estructura de las criptas. Tinción con hematoxilina y
eosina (10X).
En los ratones a los cuales se les administraron los 5
ciclos de DSS (Fig. 4B-C y D) (Tabla 2), se observó la
puntuaciónmás alta de inflamación, según la escala de
Okayasu et al. (21). Sin embargo, el daño microscópico
del colon fue significativamente menor en todas las
regiones del colon en los animales de los grupos DSS +
pre-probiótico y DSS + probiótico en el período
estudiado, en comparación con el respectivo grupo
control DSS (P<0,05) (Fig. 4C-D). No hubo diferencias en
los parámetros histológicos de colitis entre los grupos
tratados con el preparado probiótico (Tabla 2).
Los datos relativos a la incidencia de displasia leve se
presentan en la Tabla 2 y se expresan como el número
de ratones portadores de lesiones, dividido por el
número total de animales por grupo. La severidad de la
displasia se correlacionó positivamente con el número
de ciclos administrados DSS y el grado de inflamación.
Después de 5 ciclos de DSS, los animales desarrollaron
displasia de bajo grado, que se detectó en el 80% de los
ratones del grupo control DSS. Se observó una reducción
de la incidencia de displasia de bajo grado en ratones
pre-tratados y tratados con el preparado probiótico en
comparación con el grupo control de DSS (60% y 40%,
respectivamente).
Tabla 2 Evaluación histológica e incidencia de displasia leve, según
Okayasu et al. [21], en el modelo de colitis crónica inducida por
dextrano sulfato de sodio (DSS).
Grupo
No. de
animales
Puntuación de
Colitis
Grado de
displasia leve
Agua
10
0
0
Probiótico
10
0
0
DSS
10
1,92 ± 0,1 *
8/10 (80%)
DSS + Pre-probiótico
10
1,18 ± 0,1
§
6/10 (60%)
DSS + Probiótico
10
1,23 ± 0,2
§
4/10 (40%)
(*) p<0,001 con respecto al grupo control Agua. (§) p<0,05 con respecto al grupo control DSS.
EFECTOS DEL PREPARADO PROBIÓTICO SOBRE LOS NIVELES DE
EXPRESIÓN PROTEICA DE ENZIMAS Y CITOCINAS PRO-INFLAMATORIAS
Para apoyar los efectos anti-inflamatorios
beneficiosos del preparado probiótico en la colitis
ulcerosa e investigar su posible mecanismo de acción, se
determinaron los niveles de expresión proteica de la
enzima COX-2, así como la producción y niveles de
expresión génica de la citocina pro-inflamatoria TNF-
las cuales han sidoaltamente correlacionado con la EII
(Fig. 5, 6 y 7). El nivel de expresión de la proteína COX-2
en el colon fue muy elevado en los ratones con colitis
inducida por la administración de 5 ciclos de DSS al 0.7%,
respecto a los grupos control agua y control probiótico,
en los cuales se detectaron niveles muy reducidos de
dicha proteína. Interesantemente, los animales que
recibieron DSS + pre-probiótico y DSS + probiótico
Efectos de un probiótico en un modelo de colitis experimental crónica en ratones por la ingesta de DSS 39
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presentaron unos niveles de expresión de esta enzima
significativamente más bajos con respecto al grupo
control DSS.
Figura 5 Análisis representativo mediante western blot de la proteína
ciclooxigenasa-2 (COX-2) tras la administración del preparado
probiótico en ratones con colitis inducida por 5 ciclos de dextrano
sulfato sódico (DSS) al 0.7%. El análisis densitométrico fue valorado
comparándolo con el control de -actina. (***) p<0.001 vs. Agua, (+++)
p<0.001 vs. DSS. La expresión de -actina fue la misma en todas las
muestras.
Los resultados correspondientes a la producción de
TNF-demostraron un incremento significativo de los
niveles de este parámetro en el grupo control DSS, hasta
llegar al valor de 1,453 ± 0.25 pg/mg tejido en relación
con los obtenidos en mucosa colónica de animales sanos
que únicamente recibieron agua (0,51± 0.13 pg/mg
tejido). Por el contrario, en los grupos DSS + pre-
probiótico y DSS + probiótico, los valores de esta citocina
disminuyeron significativamente con respecto al grupo
control DSS (figura 6).
Figura 6 Producción de la citocina factor de necrosis tumoral alfa (TNF-
, pg/mg tejido) en tejido de colon, siguiendo el modelo experimental
de colitis crónica inducida por DSS al 0,7% y la administración del
preparado probiótico. (***) p<0.001 vs. Agua (++) p<0.01 vs. DSS.
En cuanto a la expresión génica del TNF-
se encontró niveles muy elevados de esta citocina,en
aquellos ratones con colitis inducida por la
administración de los 5 ciclos de DSS al 0.7%, respecto a
los grupos control sano. Interesantemente, los animales
de los grupos DSS + pre-probiótico y DSS + probiótico
mostraron unos niveles de expresión de esta citocina
significativamente más bajos con respecto al grupo
control DSS (Figura 7).
Figura 7 Expresión génica de la citocina factor de necrosis tumoral alfa
(TNF-) en tejido de colon, siguiendo el modelo experimental de colitis
crónica inducida por DSS al 0,7% y la administración del preparado
probiótico. Los resultados se analizaron por el método de
cuantificación relativa (2-
40 Bolívar-González S, Talero Barrientos E, Motilva Sánchez V.
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DISCUSIÓN
Los probióticos son bacterias vivas que, cuando se
administran en cantidad suficiente, presentan
propiedades beneficiosas para la salud del individuo que
los ingiere. Se ha demostrado que la flora intestinal
desempeña un papel importante en la iniciación y el
mantenimiento de la CU (23, 24); es así, como diversos
estudios han confirmado que la administración de
bacterias probióticas confieren efectos beneficiosos en
varios modelos de colitis experimental en animales (25-
30), y en ensayos clínicos con humanos(31, 32);
principalmente los probióticos actúan regulandoel
microambiente de la mucosa intestinal. Sin embargo, los
mecanismos moleculares por los cuales estos
probióticos ejercen sus efectos terapéuticos aún no han
sido esclarecidos.
El objetivo principal de la investigación ha sido valorar
los efectos de la administración, tanto de forma
preventiva como terapéutica de un preparado
probiótico en un modelo experimental de colitis crónica
en ratones inducida por la administración cíclica de DSS
al 0,7% en el agua de bebida. El tratamiento con DSS es
un modelo bien aceptado para la EII, ya que se considera
que el proceso inflamatorio provocado por este tóxico
reproduce en buena medida las manifestaciones clínicas,
macroscópicas, histológicas e inmunológicas de la colitis
humana clínica (33). En el estudio se ha llevado a cabo la
evaluación de la respuesta inflamatoria mediante el
análisis histológico de las lesiones colónicas, así como la
cuantificación de biomarcadores asociados con la colitis,
incluyendo la citocina TNF--
2.
Los resultados evidenciaron que la administración oral
de 5 ciclos de DSS en el agua de bebida indujo en los
animales un cuadro importante de colitis inflamatoria
crónica, que se correlacionó positivamente con el
número de ciclos de DSS administrados. El daño colónico
fue confirmado por la reducción detectada en la longitud
del colon en estos animales. El tratamiento con el
probiótico, tanto de manera preventiva como
terapéutica, atenuó los signos externos de la colitis, tales
como la presencia de diarrea, el sangrado rectal y la
pérdida de peso, así como también la reducciónen el
acortamiento del colon observado en los animales que
recibieron DSS. Estos resultados se relacionan con
estudios anteriores, en los cuales demostraron que los
probióticos suprimen la colitis en varios modelos
experimentales en animales y en pacientes con EII (34,
28, 35).
Aunque el mecanismo de la colitis experimental
inducida por DSS no se comprende totalmente, la
mayoría de los estudios in vivo sugieren que este tóxico
causa colitis debido a los daños que produce
directamente sobre las células epiteliales colónicas
ubicadas en la base de las criptas. Como resultado se
produce una respuesta inflamatoria en la mucosa,
caracterizada por la activación de linfocitos Th1 y Th2 y
la consecuente liberación de citocinas pro-inflamatorias
(36, 37). En estas condiciones, estas moléculas son
responsables de la infiltración de la mucosa y de la
activación de diferentes poblaciones de leucocitos que
contribuyen al desarrollo de la colitis (38). De manera
similar, los resultados del estudio histológico mostraron
que el colon de los animales que recibieron
únicamentelos 5 ciclos de DSS presentaba una
inflamación generalizada, detectándose la distorsión en
la arquitectura de las criptas y la presencia de un
infiltrado inflamatorio a nivel de la mucosa y de la
submucosa. Además, la mayoría de los animales de este
grupo desarrollaron bajo grado de displasia. Los datos
microscópicos obtenidos en los animales que los grupos
DSS + pre-probiótico y DSS + probiótico confirmaron los
resultados macroscópicos, reflejando una atenuación de
la desestructuración de la mucosa y una importante
reducción del infiltrado inflamatorio, así como una
menor incidencia de displasia leve. De acuerdo con
nuestros resultados, Appleyard y cols (2011) (18)
reportóque los animales tratados con el probiótico
VSL#3 presentaron un daño microscópico
significativamente menor con el grupo control, en un
modelo de colitis con trinitrobencenosulfónico (TNBS)
asociado a displasia.
Considerando que la disminución en la infiltración de
las células inflamatorias en la mucosa podría ser debida
a una reducción en los niveles de ciertas citocinas pro-
inflamatorias, el siguiente paso fue determinar la
expresión de la citocina TNF-
los animales del estudio. Los resultados mostraron una
disminución significativa en la producción de esta
citocina así como su expresión génica, en los grupos de
ratones tratados con DSS + pre-probiótico y DSS +
probiótico, en comparación con el grupo control DSS.
Estos datos concuerdan con estudios previos que han
señalado la eficacia y efectos beneficiosos de cepas
probióticas bacterianas, en la reducción de marcadores
pro-inflamatorios. En este sentido, Madsen y cols.,
(2001) (39), demostró que elprobiótico VSL#3fue capaz
de disminuir la gravedad de la colitis en ratones
knockout en el gen de la interleucina 10, debido en parte
a la disminución de la producción de TNF-
El hecho de que el preparado probiótico reduzca la
inflamación asociada con la colitis producida por DSS,
Efectos de un probiótico en un modelo de colitis experimental crónica en ratones por la ingesta de DSS 41
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según el modelo experimental utilizado, es una
característica muy interesante con respecto al potencial
de estas bacterias como agentes terapéuticos. Sin
embargo, estas propiedades beneficiosas observadas en
el trabajo no coinciden con los resultados de un estudio
previo realizado por Gaudier y cols., (2005) (40). Estos
autores evidenciaron que el tratamiento con una mezcla
de probióticos de manera curativa no fue capaz de
revertir los daños macroscópicos e histológicos, ni el
incremento en los niveles de TNF-
administración de DSS. El hecho de que se hayan
observado resultados contradictorios en ambos trabajos
podría explicarse por las diferentes condiciones
experimentales usadas. Así, Gaudier y cols., (2005) (40),
llevaron a cabo un modelo de colitis moderada inducida
por la administración de DSS al 1% durante cinco días y
mantenida por la adición de DSS al 0.2% durante 14 días.
En dicho estudio, el preparado bacteriano fue
administrado mediante sonda oral durante la etapa de
mantenimiento de la colitis, es decir únicamente
durante 2 semanas. Por el contrario, en nuestro el
modelo experimental, la inflamación crónica ha sido
inducida por la administración de diferentes ciclos de
DSS (un total de 5 ciclos), y el preparado probióticoha
tenido lugar durante un periodo de tiempo que ha
comprendido aproximadamente 3 meses. Consideramos
nuestro modelo especialmente interesante, ya que al
alternar periodos de daño/remisión presenta una mayor
semejanza con la colitis humana clínica.
En otra línea de trabajo, el interés se ha centrado en
la relación de la enzima inducible COX-2 con el proceso
inflamatorio crónico. Numerosos artículos demuestran
cómo esta proteína aumenta en la EII generando
múltiples productos que agravan el proceso patológico
(41, 42). Además, evidencias previas sugieren que esta
enzima desempeña un importante papel en la
etiopatogénesis del Cáncer Colorrectal (CCR). Este hecho
ha sido confirmado en un estudio llevado a cabo por
Taleroy cols., (8) utilizandoun modelo de inflamación
intestinal crónica, provocada por la ingestión de DSS en
el agua de bebida, que evoluciona a displasia y CCR (8).
En dicho trabajo se evaluó la progresión de la
enfermedad a lo largo del tiempo, sacrificando los
animales luego de recibir 5, 10 ó 15 ciclos de DSS. Los
resultados demostraron que los mayores niveles de
expresión de la proteína COX-2 coincidieron con la
máxima respuesta inflamatoria (que tuvo lugar en el 10º
ciclo) y posteriormente disminuyeron. Por ello, dichos
resultados confirman el hecho de que esta enzima se
induce en una fase temprana durante el proceso
inflamatorio y está implicada en el inicio del cáncer.
Las primeras evidencias que muestran el efecto de los
probióticos en la expresión de COX-2 han sido
publicadas, por Otte y cols., (2009) (43). Estos autores
observaron en células de cáncer de colon, una marcada
disminución en la expresión de esta proteína, así como
la secreción de prostaglandina 2 (PGE2) por acción de
estas bacterias. En la misma línea, se ha demostrado que
los probióticos podrían reducir la expresión de la COX-2
en un modelo de daño hepático inducido por una dieta
alta en grasas en ratas jóvenes (44). Otro estudio reveló
que el Lactobacillus casei, una de las cepas que
componen nuestro preparado probiótico, atenuó la
expresión de COX-2 en un modelo de colitis inducida por
TNBS (45). En el modelo animal de colitis crónica
utilizado se confirmó que la administración de DSS
aumentaba significativamente los niveles de expresión
de esta enzima inducible. Interesantemente, el
tratamiento tanto preventivo como terapéutico del
preparado probiótico del estudio provoca una marcada
disminución en la expresión de la proteína COX-2.
Como se ha mencionado anteriormente, esta
investigación se ha centrado en evaluar los efectos de la
administración de un preparado probiótico, tanto de
forma preventiva como terapéutica, en la colitis crónica.
Por ello, un grupo de animales recibió este preparado
durante dos semanas antes del inicio de la enfermedad y
otro grupo justo en el momento de la inducción de la
colitis. Los resultados confirmaron que en ambos grupos
de animales, el preparado probiótico mostró efectos
beneficiosos en la colitis inflamatoria; sin embargo no se
apreciaron diferencias significativas entre los dos grupos
de ratones. Por tanto, se concluye que en el modelo
utilizado no hay diferencias entre los beneficios de la
administración profiláctica del preparado probiótico
frente a la preventiva.
En resumen, los resultados confirman que el
preparado probiótico es eficaz contra la colitis crónica
experimental inducida por DSS, ya que reduce el grado
de inflamación, la incidencia de displasia leve y la
infiltración de neutrófilos. Del mismo modo, también se
ha observado una atenuación en la expresión y
producción de biomarcadores asociados con la colitis,
incluyendo la citocina TNF- -2, tras su
administración crónica.
AGRADECIMIENTOS
El autor expresa su agradecimiento al Centro de
Investigación, Tecnología e Innovación (CITIUS) de la
Universidad de Sevilla por la prestación de asistencia
técnica para la investigación.
42 Bolívar-González S, Talero Barrientos E, Motilva Sánchez V.
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